Родился 17 (29) сентября 1820 в семье мелкого чиновника в Твери. В 1828 семья Забелиных переселилась в Москву. Образование получил в Преображенском сиротском училище, куда был определен после смерти отца.
По окончании училища в 1837 Забелин был зачислен канцелярским служащим в Оружейную палату Московского Кремля – в ту пору не только музей, но и богатое архивное хранилище. Не получив высшего образования, юноша, однако, решил посвятить себя историческим исследованиям, поиску и изучению документов о старом быте Московской Руси.
В 1840 написал первую статью – о выездах царской семьи в 17 в. на богомолье в Троице-Сергиев монастырь, которая была напечатана в приложениях к «Московским ведомостям». За ней последовали другие труды. Наиболее известный труд Забелина – Домашний быт русского народа в ХVI и ХVII столетии – вышел в двух томах: Домашний быт русских царей в ХVI и ХVII столетии (т. I, 1862) и Домашний быт русских цариц в ХVI и ХVII столетии (т. II, 1872).
Жизнь Московского дворца воспроизводится в нем с повседневной конкретностью, детальным описанием церемониалов и обрядности. Будучи влюбленным в предмет своего изучения – быт прошлого, автор, однако, не идеализировал допетровское время. Забелин писал: «Жизнь допетровского общества не представляет собой ничего такого, что могло пленить наше воображение. На тощей почве родовых и семейных отношений напрасно станем искать тех сочных плодов общественности, которыми так богата жизнь других народов». Поэтому его книга была прохладно встречена и славянофилами, и их оппонентами из «западнического» лагеря.
В 1848 Забелин был назначен помощником архивариуса, в 1855 – архивариусом Московской дворцовой конторы. В 1859, став штатным сотрудником Петербургской археологической комиссии, серьезно занялся археологией, в течение 7 лет проводил раскопки скифских курганов на юге России в Поднепровье и на Таманском полуострове.
Велика заслуга Забелина в создании исторического музея в Москве. С 1872 он входил в комиссию по постройке здания музея, а в 1884 был назначен товарищем председателя музея (председателем был московский губернатор великий князь Сергей Александрович), став, таким образом, фактическим руководителем музея и организатором его музейных фондов.
Всю жизнь Забелин занимался коллекционированием. В его собрание входили рукописи, карты, иконы, эстампы, нумизматические знаки, обширная библиотека. Коллекция, в соответствии с завещанием владельца, была передана в Исторический музей.
В 1880 Московская дума назначила Забелина руководителем группы по написанию Истории Москвы. В связи с подготовкой этого издания вышел целый ряд работ ученого: Материалы для истории, археологии и статистики Москвы (ч. 1–2, 1884–1891), Опричный дворец царя Ивана Васильевича (1893) и др., а в 1902 – первая часть его знаменитой книги История города Москвы, за которую автор был награжден золотой медалью Московского археологического общества. Вторая часть осталась в рукописи.
Умер Забелин в Москве 31 декабря 1908. Похоронен на Ваганьковском кладбище.